Comprobación de la Síntesis de ADN

La comprobación de la síntesis de ADN se realizaba de forma indirecta, utilizando diferentes métodos para verificar las suposiciones, ya que no se podía observar directamente el proceso debido a la falta de métodos adecuados en ese momento.

Separación de Lazos Dobles

Se planteó la posibilidad de utilizar nucleasas para separar los lazos dobles del ADN. Sin embargo, las nucleasas rompen las cadenas de ADN, convirtiéndolas de lazos a cadenas lineales. Su uso se consideraba para deshacer las cadenas circulares y obtener una proporción similar de cadenas lineales (molde), lazos (molde) y cadenas sintéticas (lazos y lineales). No obstante, la separación deseada no se logró solo con nucleasas, sino que también se requirió calor para separar las dobles cadenas circulares sin romperlas. Si se hubiera utilizado solo nucleasa, se habría perdido el trabajo de la enzima unidora.

Comprobación de la Actividad Transformante

Comprobar la actividad transformante no era suficiente para demostrar que la ADN polimerasa había formado correctamente un ADN sintético, ya que solo se sabría que una pequeña parte estaba bien formada. Más tarde se descubrió que la forma de verificar si el ADN estaba bien formado era comprobar si era infeccioso, ya que bastaba un error en uno de sus 5.500 nucleótidos para que el ADN del virus dejara de serlo.

Importancia de los Descubrimientos de Sinsheimer

Sinsheimer descubrió que el virus ΦX174 solo es infeccioso cuando sus 5.500 bases están completa y correctamente formadas y colocadas. Este hallazgo fue crucial para Kornberg, ya que le permitió concluir que si el ADN sintético está bien formado por la polimerasa, será capaz de realizar lisis y luego obtener el virus completo.

Avances de Ochoa y Manago con el ATP

Ochoa y Manago lograron crear ARN in vitro al unir nucleótidos y suministrarles una activación. Esto motivó a Kornberg a investigar el proceso, ya que su objetivo era crear ADN in vitro y obtener información sobre la necesidad de activar los nucleótidos para que fueran funcionales.

Finalidad de los Materiales y Técnicas

Bacillus subtilis

Se utilizó la bacteria Bacillus subtilis debido a su ciclo de reproducción corto (20 minutos), lo que la hacía más adecuada que las células animales. Sin embargo, su ADN no pudo proporcionar respuestas ya que se fragmentaba al extraerlo debido a su gran tamaño.

Tritio

El tritio se utilizó como marcador para diferenciar el ADN nuevo del molde y verificar si al duplicarse lo hacía con naturalidad y con las mismas características que su molde.

Calor

En el segundo trabajo, se utilizó calor para separar los lazos de las dobles cadenas sin necesidad de romperlas.

Microscopio Electrónico

El microscopio electrónico se empleó para observar el comportamiento del ADN durante la duplicación y verificar si se había formado correctamente.

Segundo Examen

Trabajo con Bacillus subtilis y Capacidad Transformante

Kornberg buscaba comprobar el correcto funcionamiento de la ADN polimerasa. El método elegido fue verificar si el ADN sintético funcionaba correctamente. Sin embargo, el ADN de Bacillus subtilis era demasiado largo y complejo para el análisis que buscaba, ya que se rompía cada vez que trabajaba con él.

Avances y Limitaciones del Experimento del Vecino

El experimento del vecino permitió descubrir 16 posibles combinaciones en los pares de vecinos en una cadena de ADN, ya que había 4 posibilidades por cada base. Este método permitió asegurar qué vecino tenía la base que se marcaba. Sin embargo, la limitación del método era que no permitía descubrir el orden de las bases ni comprobar si el ADN sintético estaba bien formado o si la ADN polimerasa funcionaba correctamente.

Análisis de los Extractos Celulares

En sus primeros experimentos, Kornberg no se percató de que los extractos celulares contenían tanto las partes responsables de crear la célula y las nuevas cadenas de ADN como las de destruirla. El texto describe el momento en que se da cuenta de esto y entiende que antes de realizar sus experimentos, debe purificar los extractos eliminando las partes degradantes.

Separación de Lazos Dobles con Nucleasa

No se utilizó solo nucleasa para separar los lazos dobles. Se empleó calor y nucleasa para separar el ADN patrón de su ADN sintético y romper los enlaces dobles, pero no para separar los patrones de los sintéticos.

Formulación de un Virus Completo

Kornberg no logró formular un virus completo, solo el ADN del virus. Sabía, por el experimento de Buchner con la levadura, que esto era suficiente para que se realizara la lisis y luego se obtuviera un virus completo.

Finalidad de los Materiales y Técnicas

E. coli

Se utilizó E. coli porque se conocía la forma en que el virus se replicaba en esta célula, la cual también era conocida por los científicos. Se eligió porque al introducir el virus en las células de E. coli, se sabía que se podía producir lisis.

Enzima Unidora

La enzima unidora se utilizó para crear un lazo doble de la cadena del ADN del virus y convertirla en una cadena circular. Una cadena no enlazada no permite la lisis del virus.

Lisozima

La lisozima se empleó para romper la pared celular de E. coli e introducir el ADN del virus en ella.