Observación de microorganismos al microscopio. Se pueden visualizar con microscopio óptico x 2 métodos: en fresco y empleando técnicas de tinción.
Observaciones en fresco de microorganismos
Objetivo es observar a microorganismos vivos y estudiar movilidad bacteriana. Las técnicas son:
- Método de cámara húmeda: se pone 1 gota de muestra en centro del portaobjetos, y sobre ella colocar un cubre sin formar burbujas de aire.
- Técnica de gota pendiente: se sitúa 1 gota de muestra en centro del cubre, y colocando encima de dicha gota el hueco de portaobjetos excavado. Luego se gira el conjunto y la gota quedará pendiente del cubre.
- Coloración vital: se emplea para poder visualizar ciertas estructuras de microorganismos sin causar muerte inmediata. Se usan colorantes a muy bajas concentraciones para reducir su toxicidad, como rojo neutro (1:10000) y azul de metileno (1:24000). Se prepara una cámara húmeda y añadiendo colorante por el borde del cubre. Se observa al microorganismo con 10x y 40x.
- Observación en medio viscoso: se añade a la preparación 1 gota de disolución de sacarosa, para aumentar viscosidad del medio y obstaculizar movimiento de microorganismos. Así se podrán ver más fácilmente en microscopio.
Observación de microorganismos teñidos
El objetivo es contrastar microorganismos frente al campo microscópico y poder ver morfología, agrupación y estructuras internas. Fases de una tinción:
- Extensión: poner 1 gota de muestra, si es líquida, sobre portaobjetos limpio y desengrasado y extenderla con ayuda del asa de siembra. Si es sólida se pone junto con 1 gota de agua esterilizada que facilite la extensión.
- Desecación: se deja secar la extensión a temperatura ambiente, o se acerca a llama pero sin ponerla encima de ésta.
- Fijación: tiene 2 objetivos: Pegar microorganismos al portaobjetos, para que no se pierdan durante coloración y lavado. Desnaturalizar proteínas de la pared celular o del citoplasma, haciéndolas más idóneas para penetración del colorante. Puede hacerse por agentes físicos como calor, pasando el portaobjetos de forma rápida 2 o 3 veces por llama de mechero. Es importante hacerlo con muestra desecada, pues si hubiese agua ésta herviría y bacterias se romperían, dificultándose su observación. También puede hacerse por agentes químicos como ácido acético, ácido orgánico como el tricloroacético y pícrico; o solventes orgánicos reductores como acetona, alcohol 96°, alcohol en éter y otros.
- Tinción: se utilizan sustancias químicas (colorantes), capaces de teñir estructuras orgánicas por su capacidad para unirse con diferentes estructuras celulares y tejidos, creando cambios de color y de densidad óptica. La molécula del colorante posee 2 grupos: el “cromóforo” que es el encargado del color, pero no tiñe sin la ayuda del grupo “auxocromo”, que no tiene color pero une el grupo cromóforo a la estructura a teñir. Para ayudar a la penetración del colorante se utilizan mordientes o sustancias que refuerzan la acción de los colorantes, que no tiñen, como lugol, taninos y otros.