Endonucleasas y Enzimas de Restricción

Las endonucleasas que rompen ADN, fragmentan la hebra de ácidos nucleicos por muchos lugares. Las enzimas de restricción, por el contrario, rompen la doble hebra solo si reconocen una secuencia determinada. Estas poseen una especificidad de rotura.

1. Son de origen bacteriano.
2. Normalmente cortan al ADN en puntos característicos que a menudo presentan secuencias polindrómicas de 4, 6 y 8 nucleótidos.
3. Según la posición de corte existen extremos suaves o sobresalientes de la doble hebra.
4. El tamaño de la secuencia: la frecuencia de corte media es (1:46).

El Mapeo de restricción sirve para localizar un corte de ADN del genoma correspondiente con fines concretos. Por ejemplo, en virus y bacterias son de gran ayuda en el análisis estructural de genes y requieren el uso de 3 o más enzimas de restricción.

Recombinación de las Moléculas de ADN

Llamamos extremos cohesivos a la unión de extremos sobresalientes y extremos complementarios de cualquier ADN cortado con la misma enzima. 2 fragmentos de ADN de diferentes regiones genómicas forman el ADN recombinante. Los vectores más usados son los bacteriófagos, es decir, virus de bacterias con ADN circular, así como plásmidos.

La Clonación

La clonación se lleva a cabo tras unos pasos a seguir:

1. Se linealiza el ADN del plásmido con la misma enzima de restricción que se usa para fabricar el fragmento.
2. Se mezclan ambos ADN. Los extremos cohesivos hibridan con los extremos libres y cubren el ”hueco” del ADN plásmido.
3. El resultado es un ADN circular aumentado.
4. Una ADN-ligasa precinte la rotura de la hebra.
5. El plásmido recombinante se introduce en la E. Coli donde puede multiplicarse. (”El proceso se llama transformación”).

Vectores utilizados en la clonación molecular son:

• Plásmido (bacteria, levadura) con ADN circular y < 5-10kb.
• Bacteriófago lambda (bacteria) con ADN lineal viral y sobre 20Kb aprox.
• Cósmido (bacteria) híbrido entre fago y bacteriófago con aprox 50Kb.
• YAC (levadura) con ADN con el centrómero telómero y presenta megabases.

Estructura de pBR322

Es el típico vector de clonación, procede de un plásmido natural, tiene genes con resistencia a antibióticos, tiene un sitio de restricción único para la inserción de ADN foráneo y tiene un origen de replicación para su propagación en E-coli. Cuando se siembran bacterias se observa una ”montañita”. Se hace una réplica para saber qué bacterias debemos seleccionar, ya que habrá ADN humano o plásmido. Nos interesará la que aparezca ADN humano, que es donde se encontrará la bacteria, la tetraciclina. El conjunto de colonias se llama genoteca y no está ordenada porque procede de la digestión.

• Digestión parcial: fragmentos solapantes.
• Digestión total: solo hay un sitio de corte en el plásmido.

Las digestiones parciales permiten que no todos los sitios posibles susceptibles de corte por las enzimas de restricción sean cortadas y forman fragmentos solapantes. La solapación de fragmentos asegura que todas las secuencias serán clonadas. Los fragmentos solapantes permiten la construcción de mapas físicos más largos a partir de los datos de secuenciación.

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el modo más sencillo de multiplicar un segmento de ADN específico. Una condición previa es conocer partes de las secuencias del ADN de interés.

1. Se sintetizan 2 oligonucleótidos que hibridan cada uno en 2 hebras complementarias.
2. Se calientan a 95º para la desnaturalización.
3. Se refrigera a 55º los iniciadores se unen a una hebra individual y actúan de iniciadores para la reacción del ADN-polimerasa. La síntesis se realizan en 5’— > 3’ (polimerización).
4. Tras unos 30 ciclos el segmento amplificado.

El PCR es usado para el diagnóstico de virus, defectos genéticos, medicina forense.

Renaturalización

Si se calienta un dúplex de ADN a 90º se produce una desnaturalización. Este proceso es reversible, a temperaturas de 65º. Ambas hebras hibridan espontáneamente formando la doble hebra: renaturalización.

Southern Blotthing (ADN)

La desnaturalización y la hibridación se emplean para la determinación de un segmento de gen definido. Para ello, una mezcla de ADN se separa tras un digerido de restricción electroforéticamente y se disocia en sus cadenas individuales bajo condiciones alcalinas. Las hebras individuales se transfieren del gen mediante difusión o un campo electrónico a una matriz.

Northern Blotthing (ARNm)

Sin embargo, al seguir esta estrategia se debe conocer por lo menos la secuencia nucleótida de una sección de genes para construir una sonda complementaria. El procedimiento blotthing es útil para determinar específicamente el ARN para analizar el ARN se separan electroforéticamente el ARN. Para analizar el ARN se separan electroforéticamente mezclas de ARNm. Para determinar el ARNm de interés se utiliza una sonda de ADN.

Construcción Genoteca

Una genoteca es el conjunto de fragmentos de ADN de un organismo distribuido en un vector. Una vez construida, el siguiente paso es rastrearla (screening) a fin de seleccionar el clon o clones que llevan el gen de interés.

Técnicas de Secuenciación

• Maxam – Gilbert (método químico). Se basa en la modificación química y posterior rotura del ADN. Permite utilizar un ADN purificado sin necesidad de clonarlo.
• Sanger (método enzimático): en este método se utilizan pocos reactivos tóxicos y cantidades menores de radioactividad que en el otro método.
• Secuenciación automática: son variaciones del método Sanger. Una de ellas es por ejemplo la secuenciación por terminadores fluorescentes.

Energía Libre de Gibbs

Las reacciones que tienen lugar espontáneamente suelen ser exotérmicas, esto es, con desprendimiento de calor. El calor que se desprende o absorbe en una reacción a presión constante recibe el nombre de entalpía ΔH. Las reacciones en las que se desprende calor son exotérmicas y por convección, la entalpía se supone negativa. Sin embargo, hay reacciones endotérmicas que cursan espontáneamente, ΔH>0; por ejemplo, la disolución de sulfato amónico en agua. La disolución de sulfato amónico en agua es un proceso por el cual se pasa de un sistema altamente ordenado. La función termodinámica que mide el desorden en un sistema recibe el nombre de entropía ΔS. Puede observarse que muchas reacciones que cursan espontáneamente lo hacen con incremento positivo de entropía. Sin embargo hay procesos espontáneos que cursan con disminución de entropía; por ejemplo la solidificación del agua.

Ni la entropía ni la entalpía valen como criterio único para definir la espontaneidad de una reacción. Existe otra función termodinámica de estado que agrupa a los 2 procesos a presión constante, la Energía Libre de Gibbs, que se define así: ΔG=ΔH-TΔS. Esta energía es un criterio válido para verificar la espontaneidad de una reacción. Pueden cursar espontáneamente aquellos procesos en los que se desprende energía libre ΔG<0; no pueden hacerlo, sin embargo, aquellos procesos en los que se absorbe energía libre ΔG>0.

Sea un sistema A — > B la reacción cursará de izquierda a derecha cuando las concentraciones de A y B sean tales que la energía libre del sistema sea negativa. La energía libre del sistema viene dada por : ΔG=ΔGº + RT ln[B]/[A]. Donde ΔGº es la Energía Libre Standard de la reacción, que es la energía libre del sistema con los reactivos a concentración unidad en condiciones STP. Hay tablas que nos dan la ΔGº para toda la reacción. A partir de las mismas podemos calcular si un proceso puede tener lugar espontáneamente o no en unas determinadas condiciones.

La expresión que nos da la energía libre de un proceso tiene otra importante derivación. Para la reacción A — > B esta expresión es: ΔG=ΔGº + RT ln[B]/[A]. En el equilibrio esta expresión es: 0= ΔGº + RT ln[B]eq/[A]eq. Pero [B]eq/[A]eq= Keq por tanto ΔGº=-RT ln K eq.

En general podemos decir que las reacciones catabólicas ΔG<0 y las anabólicas ΔG>0. Supongamos una reacción anabólica mediante la cual se forma un enlace químico entre A y B; A+B — > A-B ΔG>0. La reacción no puede tener lugar espontáneamente ¿Cómo puede entonces tener lugar en el metabolismo? Lo que ocurre en metabolismo es que las reacciones endergónicas ΔG>0 se acoplan a reacciones exergónicas ΔG<0 de manera que la energía desprendida en una de las reacciones es absorbida por la otra. La suma total de energías libres de una y otra reacción da una ΔG<0, por lo que el proceso en conjunto tiene lugar espontáneamente. Así la reacción A+B — > A-B con ΔG1>0 Se acopla a X-Y+H2O — > X+Y con ΔG2<0 siendo |ΔG2|>|ΔG1|; dando lugar a una reacción global. A+B+X-Y+H2O — > A-B+X+Y ΔG<0.

De esta manera, los procesos catabólicos productores de energía generan ATP, que se empleará en todas aquellas reacciones endergónicas en las que sea requerido. En general el ATP, 5’-adenosina trifosfato, se produce de 2 maneras:

1. Por fosforilación a nivel de sustrato (procesos anaeróbicos, fermentativos).
2. Por fosforilación oxidativa (procesos aeróbicos, oxidativos).