Dianas Terapéuticas: Descubrimiento y Validación

Definición y Tipos

Una diana terapéutica es una molécula, generalmente un receptor, sobre la que actúa un fármaco para desencadenar una serie de reacciones intracelulares con finalidad terapéutica. En el caso de los biofármacos, las dianas terapéuticas suelen ser genes que codifican proteínas específicas, las cuales desencadenan la acción farmacológica.

Tipos de dianas:

• Proteínas
• ADN
• ARN
• Azúcares

Proceso General del Descubrimiento y Desarrollo de Fármacos

1. Descubrimiento de dianas (identificación y validación).
2. Descubrimiento del fármaco (identificación y optimización).
3. Desarrollo del fármaco (Fases I, II y III).
4. Comercialización.

Proceso de Descubrimiento de Dianas Terapéuticas

1. Identificación de Dianas

Se buscan dianas (genes candidatos) que tengan alguna relación con la patología de interés. Las técnicas más comunes incluyen:

• Análisis de expresión génica: Cuantificación de proteínas y ARNm obtenidos por transcripción y traducción de ADN. Se comparan perfiles de expresión entre individuos sanos y enfermos, o entre diferentes estadios de la enfermedad, para identificar genes que se expresan de manera diferencial (oncogenes o genes supresores de tumores).
• Análisis de interacción entre proteínas: Identifica proteínas que interactúan entre sí, lo que puede revelar nuevas dianas terapéuticas.
• Fenotipos: Análisis de perfiles fenotípicos entre organismos para la identificación y validación de dianas terapéuticas.

A. Técnicas de Análisis de la Expresión Génica

1. Análisis Serial de la Expresión Génica (SAGE):
   • Analiza el ARNm utilizando secuencias cortas (10-14 pb) que identifican cada transcrito.
   • Las secuencias se agrupan y se secuencian para determinar la abundancia de cada ARNm.
   • Permite identificar genes que se expresan diferencialmente entre individuos sanos y enfermos.
2. Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE):
   • Separa moléculas (ADN, ARN, proteínas) según su tamaño y carga eléctrica.
   • Utiliza un gel de poliacrilamida como tamiz molecular.
   • Requiere tinción de las moléculas para su visualización con espectrofotómetro de masas o luz UV.
   • Permite cuantificar proteínas y ARNm, identificando genes que se expresan diferencialmente.
   • Limitación: Bajo rendimiento.
   • Consideraciones para proteínas: Se utilizan alcoholes (desnaturalización) y soluciones iónicas (dodecil sulfato de sodio) o diferentes pH para asegurar la carga y prevenir estructuras variables.
3. Tipos de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa):
   • PCR-RFLP (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción): Utiliza endonucleasas de restricción para diferenciar alelos y detectar variaciones genéticas que podrían ser dianas terapéuticas.
4. Microarray de ADN:
   • Permite identificar y validar dianas terapéuticas simultáneamente.
   • Analiza todos los genes del individuo.
   • Procedimiento:
     1. Se obtiene ADN complementario (ADNc) a partir de ARNm mediante retrotranscripción inversa.
     2. Se colocan sondas de ADN complementarias a cada gen (con fluoróforos) en una placa.
     3. Se hibrida la placa con ADNc de muestras de pacientes sanos (fluoróforo verde) y enfermos (fluoróforo rojo).
     4. Se analiza la fluorescencia para identificar genes con expresión diferencial:
        • Rojo: Gen activado en el individuo enfermo (posible oncogén).
        • Verde: Gen activado en el individuo sano (posible gen supresor de tumores).
        • Negro: Gen expresado por igual en ambos individuos (no relacionado con la patología).

B. Análisis de Interacción entre Proteínas

1. Microarray de Proteínas:
   • Similar al microarray de ADN, pero utiliza proteínas (enzimas, anticuerpos, etc.) como muestra.
   • Menos específico que la hibridación de ADN.
   • Identifica proteínas relacionadas con la enfermedad y extrapola los posibles genes candidatos.
2. Sistema de Doble Híbrido en Levaduras:
   • Estudia la interacción entre dos proteínas en levaduras (solo en eucariotas).
   • Utiliza un factor de transcripción que activa un gen reportero.
   • Limitación: Posibles falsos positivos debido a interacciones entre proteínas de la levadura.

2. Validación de Dianas

Se seleccionan las dianas potencialmente relacionadas con la enfermedad y se determina cómo modificar su actividad para lograr un efecto terapéutico. Después de esto, comienza el desarrollo del fármaco.

Técnicas de Validación

A. Modulación de la Expresión Génica

Se altera la expresión (inhibición o activación) de los genes candidatos y se observa el fenotipo resultante para determinar su relación con la enfermedad. Generalmente, se inhibe la expresión del ARNm. Estas técnicas suelen ser inestables y sensibles a la degradación.

1. Oligonucleótidos Antisentido:
   • Fragmentos monocatenarios de ADN o ARN complementarios al ARNm diana.
   • Impiden la traducción del ARNm (inhibición temporal).
   • Se introducen en la célula mediante liposomas o vectores.
2. ARN de Interferencia (ARNi):
   • Utiliza pequeños ARN de interferencia (siARN) para silenciar genes.
   • Provoca la degradación del ARNm o inhibe la transcripción.
   • Se introduce el gen que codifica el ARNi en la célula mediante liposomas o vectores.
3. Ribozimas:
   • Fragmentos de ARN con actividad catalítica que escinden el ARNm diana.
   • Se introduce el gen que codifica la ribozima en la célula mediante liposomas o vectores.
4. Proteínas con Dedos de Zinc:
   • Técnica más estable.
   • Diseño de factores de transcripción con regiones proteicas que se unen a secuencias específicas del ADN.
   • Permiten activar o inhibir la expresión de genes específicos.
   • Se introduce el gen que codifica la proteína en la célula mediante vectores.

B. Análisis de la Expresión Génica *in situ*

Utiliza tejidos o células para observar directamente las alteraciones en el fenotipo y validar las dianas terapéuticas.

1. Microarray de Tejido *in vivo*:
   • Similar al microarray de ADN, pero utiliza muestras de diferentes tejidos en lugar de sondas de ADN.
   • Se adhieren muestras (proteínas, ADN o ARN) para observar variaciones fenotípicas y la adhesión a tejidos específicos.
2. Microarray de Células:
   • Similar al microarray de ADN, pero en lugar de sondas de ADN, se fijan fragmentos de ADN que contienen los genes de interés.
   • Se aplica una disolución con células idénticas que se adhieren a los fragmentos de ADN e introducen los genes para su expresión.
   • Se observan los cambios fenotípicos en las células para validar las dianas terapéuticas.
   • También se pueden utilizar células que contienen ARN de interferencia específico.

C. Inactivación de Proteínas

Se inhibe la actividad de proteínas específicas y se observa el fenotipo resultante para determinar si los genes que las codifican están relacionados con la enfermedad.

1. Anticuerpos Monoclonales:
   • Se unen a la proteína diana y la neutralizan (impiden su unión al receptor).
   • Son inestables.
   • Si la proteína está dentro de la célula, se introduce el gen codificante mediante vectores.
2. Sustancias Químicas Específicas:
   • Compuestos diseñados para unirse selectivamente a la proteína e inactivarla.
   • Limitaciones: Selectividad (puede inactivar otras proteínas) y disponibilidad de compuestos.
3. Péptidos:
   • Fragmentos de proteína diseñados para neutralizar la proteína diana.
   • Limitaciones: Problemas de afinidad y selectividad.
4. Aptámeros:
   • Fragmentos de ADN específicos diseñados para inactivar la proteína diana.
   • Muy específicos y sensibles.
   • Limitaciones: Mala unión a proteínas con carga negativa.
   • Si la proteína está dentro de la célula, se introduce mediante vectores.
5. Láser:
   • Se utilizan anticuerpos, aptámeros o péptidos específicos unidos a un cromóforo (CALI) o fluoróforo (FALI).
   • Se aplica un láser que excita el cromóforo/fluoróforo, inactivando la proteína.

D. Modelos Vivos

Se altera la expresión génica (activación o inhibición) de ciertos genes o se introducen genes en organismos vivos para observar los fenotipos resultantes y validar la diana terapéutica. Mayor correlación *in vivo* que los modelos celulares, pero con dificultad para realizar alteraciones con precisión.

Características del modelo ideal:

• Alta tasa de reproducción en laboratorio.
• Manipulación genética factible.
• Genotipo relacionado con el humano.

1. Ratones Transgénicos:
   • Se introduce un gen de interés (transgén) de forma aleatoria en la fase embrionaria.
   • Se observa el fenotipo para validar la diana terapéutica.
   • Se introduce en el pronúcleo del óvulo fecundado por recombinación no homóloga.
   • La progenie se cruza para obtener homocigotos.
   • Se puede verificar con PCR y electroforesis.
2. Ratones *Knock-out* y *Knock-in*:
   • *Knock-out*: Se inactivan genes de interés para validar la diana terapéutica, reproducir la acción de un biofármaco o estudiar el efecto producido. Se utilizan bacterias con genes marcadores y embriones de ratón.
   • *Knock-in*: Se aumenta el número de copias de un gen para obtener sobreexpresión y validar la diana terapéutica.
   • Existen ratones *knock-out* inducibles, donde la alteración génica se activa mediante una sustancia.
3. Ratones con Mutaciones al Azar:
   • Se inducen mutaciones con sustancias mutagénicas.
   • Se selecciona la progenie portadora y se aísla a los ratones con mutaciones en el gen de interés.
   • Se observa el fenotipo para validar la diana terapéutica o utilizarlo como modelo animal.
   • Baja eficacia debido a la aleatoriedad de las mutaciones.
4. Levaduras (*Saccharomyces cerevisiae*):
   • Se relacionan con el fenotipo humano para ciertas enfermedades.
   • Se inactivan o activan genes para observar el fenotipo y validar la diana terapéutica o reproducir la acción de un biofármaco.
5. Otros Modelos:
   • Nematodos (similitud con humanos en genes y proteínas).
   • Pez cebra (embriones transparentes).
   • Mosca de la fruta (*Drosophila melanogaster*) (expresión génica variable).
6. Células Madre Embrionarias:
   • Son totipotenciales (fáciles de manipular y proliferar).
   • Se altera la expresión génica para observar el efecto en la célula resultante o en la progenie de ratones.
   • Utilizadas en estudios de cáncer.

E. Bioinformática

Permite comparar diferentes modelos obtenidos mediante las diversas técnicas de validación. Se utiliza en:

• Microarrays de ADN (para determinar la expresión génica).
• Reconocimiento de genes homólogos.
• Identificación de proteínas con funciones similares.
• Evaluación de dianas terapéuticas alternativas.

Farmacogenética

Estudia la relación entre el efecto farmacológico de un medicamento y el polimorfismo genético interindividual. Afecta a la farmacocinética (metabolismo, eliminación, distribución, retención) y a la farmacodinamia (diana terapéutica, variantes fisiológicas). Su objetivo es desarrollar tratamientos personalizados (posología, fármaco óptimo) para lograr la máxima eficacia con la mínima toxicidad.

Métodos para Inactivar un Gen Patógeno en una Célula o Tejido

• Inhibición de la traducción mediante modulación de la expresión génica con oligonucleótidos antisentido.
• Inhibición con ARN de interferencia.
• Reparación del alelo mutante por recombinación homóloga.
• Destrucción o reparación con ribozimas.

Sistemas de Expresión de Proteínas Recombinantes

La selección del sistema depende de la proteína que se desea producir:

• Células de insecto: Modificaciones postraduccionales complejas (más que las levaduras).
• Levaduras: Promotores afines, estabilidad.
• Bacterias: Fáciles de modificar genéticamente, adecuadas para proteínas pequeñas y que no requieren modificaciones postraduccionales.
• Células de mamífero: Modificaciones postraduccionales especializadas en mamíferos.

Diferencias entre Genética y Genómica

• Genómica: Estudia todos los genes a la vez (ej., microarray).
• Genética: Estudia genes individuales o en pequeños grupos.