ELECTROFORESIS:1. FUNDAMENTO:La electroforesis es una técnica analítica basada en la separación de partículas cargadas (iones o moléculas) que se desplazan a través de un medio aplicando un campo eléctrico.-.-.La electroforesis permite la separación de macromoléculas que poseen carga eléctrica (grupos aniónicos o catiónicos disociables) presentes en una mezcla como aminoácidos, proteínas y ácidos nucleicos. La aplicación más importante de la electroforesis en el laboratorio clínico es la separación de proteínas presentes en suero, orina y otros fluidos biológicos (líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial…).-.-.-.Cuando una partícula cargada se coloca bajo la acción de un campo eléctrico, si está cargada positivamente (catión), se moverá hacia el polo negativo (cátodo), y si está cargada negativamente (anión), migrará hacia el polo positivo (ánodo).-.-.-.La velocidad de desplazamiento (movilidad electroforética) de los componentes de una muestra es diferente en función de: a) La carga de la partícula -que depende del pH y composición del medio-, b) del coeficiente de fricción -dependiente a su vez del tamaño (peso molecular) y de la forma de la molécula así como de la viscosidad del medio- y, c) de la intensidad del campo eléctrico aplicado.-.-.-.Los factores que influyen en la migración de las partículas en el seno de un campo eléctrico son:a) Carga neta de la partícula:La carga eléctrica neta de la partícula sometida a electroforesis depende del pH del tampón en que se encuentra ya que condiciona el grado de ionización de las moléculas.-.-.-.Las proteínas están compuestas por aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y suelen reflejar las propiedades físicas y químicas de los aminoácidos que la componen debido a los grupos -NH2 (amino) y -COOH (carboxilo) de las cadenas laterales de los aminoácidos inicial y final de la proteína.——-…..—-Las proteínas son moléculas anfóteras cuya carga eléctrica neta es cero; al pH en que la carga eléctrica neta de la proteína es cero (el balance de cargas positivas y negativas de la molécula es cero) se llama pH isoeléctrico o punto isoeléctrico de la proteína. Al pH de su punto isoeléctrico, las proteínas no presentarán migración alguna, es decir permanecerá en su punto de aplicación al ser sometida a una corriente eléctrica.-.-.-.-.En una disolución acuosa, los grupos ionizables de las proteínas permiten que la molécula capte o ceda hidrogeniones dependiendo del pH del medio. Cuando el pH de la disolución es mayor que el punto isoeléctrico, la proteína tiende a liberar hidrogeniones y queda cargada negativamente. Si el pH es menor, la proteína tiende a captar hidrogeniones y queda cargada positivamente. Si las proteínas son sometidas a la acción de un campo eléctrico se desplazarán hacia el electrodo de signo contrario a su carga. b) Fuerza iónica del tampón:La separación electroforética implica la aplicación de un campo eléctrico que permita la movilidad electroforética de las partículas de la muestra; si la concentración iónica del tampón es alta, las partículas objeto de la separación migrarán más lentamente ya que la corriente depende de todos los iones presentes, tanto los del tampón como de los de la muestra. Así, cuanto más concentrado es el tampón mayor es la cantidad de corriente que transportarán los iones del mismo y menos por las partículas de la muestra que migrarán más despacio.-.-.-.La concentración del tampón elegido para una realizar técnica electroforética debe ser suficiente para que cumpla función, mantener el pH constante y transportar la corriente.c) Tamaño y forma de las partículas:La velocidad de desplazamiento de las moléculas de la muestra depende tanto de su carga eléctrica como de su masa molecular; su movilidad será mayor cuanto mayor sea la carga y menor la masa de la proteína. La importancia de estos factores en la electroforesis aumenta si se utilizan soportes que condicionan la separación al tamaño de la molécula -distintos tipos de electroforesis-, permitiendo el paso selectivo de las moléculas más pequeñas y reteniendo las de mayor tamaño.d) Potencial del campo eléctrico:La movilidad electroforética es proporcional a la carga de la partícula y al potencial del campo eléctrico aplicado, por tanto cuanto más alto sea éste, con más rapidez se moverá la partícula. Pero, hay que tener en cuenta que al aumentar el voltaje, aumenta la temperatura provocando efectos indeseables como la desnaturalización de las proteínas y la evaporación del buffer que condiciona el incremento de su concentración y el correspondiente aumento de su fuerza iónica. Por tanto se debe trabajar a voltajes limitados para evitar estos inconvenientes. Los sistemas de alto voltaje llevan incorporado un sistema de refrigeración para mantener la temperatura constante.2. TIPOS DE ELECTROFORESIS:2.1. Electroforesis de interfase libre:La electroforesis se realiza en un tubo en U en el cual se introducen la solución tamponada de la sustancia a separar (pH y fuerza iónica adecuadas). Se conectan dos electrodos en los brazos del tubo y la diferencia de potencial provoca la separación de las moléculas cargadas hacia los electrodos de polaridad opuesta.-.-.-.-.Las diferentes proteínas se desplazan a velocidad diferentes según su carga y coeficientes de fricción formando nubes o frentes que se desplazan en la disolución tampón. Actualmente no se utiliza debido a que se necesitan muestras muy grandes y por la complejidad de los aparatos que eviten la mezcla de las proteínas y su detección mediante sistemas ópticos.2.2. Electroforesis de zona:Los componentes de la muestra se desplazan sobre un soporte sólido -papel, acetato de celulosa, gel de agarosa…- impregnado por un tampón y bajo la acción de una corriente eléctrica.-.-.-.-.En el laboratorio de análisis clínico se utilizan la electroforesis de zona y la electroforesis capilar para realizar el proteinograma. La electroforesis de zona utiliza como soporte tiras de acetato de celulosa y gel de poliacrilamida o gel de agarosa cuando es necesario obtener un número mayor de bandas de separación en el proteinograma o, en la inmunoelectroforesis para diferenciar proteínas específicas.Los soportes utilizados en la electroforesis de zona son:a) Electroforesis papel (ya no se utiliza).b) Electroforesis en acetato de celulosa.c) Electroforesis en gel (de agarosa, de poliacrilamida).—-…–.Un gel es un estado intermedio entre el sólido y el líquido. Los geles de uso más generalizado son el gel de poliacrilamida y el gel de agarosa. Están formados por un reticulo de polímeros con un líquido intersticial. El reticulo forma poros de diferentes tamaños que condicionan la separación no sólo por la carga de la partícula sino también por diferencias en el tamaño.-.-.La electroforesis de zona permite la separación de partículas de forma efectiva pero el proceso de separación puede durar varias horas y es difícil de automatizar.2.3. Electroforesis capilar:La electroforesis capilar es una técnica analítica de separación de solutos que se lleva a cabo en el interior de tubos capilares (25-75 ìm de diámetro interno) de vidrio o sílice en los que se produce la migración diferencial de los solutos dentro de un campo eléctrico elevado creado en su interior. Estos capilares permiten disipar el calor rápidamente permitiendo aplicar campos eléctricos elevados reduciendo los tiempos de separación (5-15 minutos). Es una técnica intermedia entre la electroforesis de zona y la cromatografía líquida.Características de la electroforesis capilar:__Utiliza altos voltajes (10-30 KV)__Elevado campo eléctrico (100-300 V/cm) __Rápida (5-15 minutos)__Eficaz__Resolutiva (30 picos en 3 minutos)__Segura (desconexión automática)__Es una nanotécnica (1-50 ìl de muestra)__Detección de los componentes en el capilar__Automatizada y altamente reproducible (< 2% CV para área y pico)__Mínima contaminación y economía de reactivos__Compatible con sistema químicos y biológicos (igual separa aniones que virus)__Simplicidad de la instrumentación.3. COMPONENTES DE UN EQUIPO DE ELECTROFORESIS DE ZONA:3.1. Cubeta de electroforesis:Consiste en un recipiente en cuyo interior podemos apreciar dos zonas en las que depositaremos el tampón sin que su nivel máximo llegue a sobrepasar la barrera de separación entre ellas (el tampón de un receptáculo no entrará en contacto con el del otro). En cada zona encontramos un electrodo de carga opuesta y en contacto directo con el tampón. Los dos espacios de la cubeta están comunicados por un puente en el cual situaremos el soporte con la muestra a través del cual se producirá el paso de la corriente. La cubeta consta de una tapa que permitirá minimizar la evaporación del tampón.3.2. Alimentador para electroforesis (fuente de corriente eléctrica):Su función es transformar la corriente alterna en corriente continua. Aunque podemos variar los polos (+) y (-), generalmente utilizamos como polo negativo (-) o cátodo el color negro y como polo positivo (+) o ánodo el color rojo.3.3. Soluciones tampón:Son varias las soluciones amortiguadoras que podemos utilizar. El objetivo de cualquiera de ellas es obtener un pH adecuado para que se produzca la ionización de la totalidad de las partículas a emigrar. Los tampones más utilizados son:a) Tampón veronal sódico 0,04 M (dietilbarbiturato sódico 8,24 gr/L) con el que obtenemos un pH de 8,6.b)Tampón TRIS ( Tris-hidroximetil-metilamina) 0.09 M (10,9 gr/L)-.-.-.-.Ácido bórico 0,08 M ( 4,95 gr/L) -.-.-.-.EDTA-Na /Etilendiaminotetracético) 0,0025 M ( 0,93 gr/L)3.4. Soporte:Es lugar sobre el que se deposita la muestra y donde se produce la migración de los componentes de la muestra. Podemos clasificar los soportes en:3.4.1. No restrictivos:Separan los componentes de la muestra solo en función de la carga eléctrica. Dentro de los soportes no restrictivos está el papel -prácticamente en desuso-, el acetato de celulosa (Cellogel) -el más extendido- y el gel de agarosa. El acetato de celulosa está formado por fibras de celulosa entre las cuales se sitúa el tampón cuando sumergimos la tira antes de depositar la muestra. 3.4.2. Restrictivos:En el proceso de separación influye no solo la carga de las moléculas sino también su tamaño o características específicas debido a la presencia de poros en el soporte. Dentro de este grupo tenemos el gel de almidón y el gel de poliacrilamida.-.-.En el laboratorio clínico el soporte de acetato de celulosa y el gel de agarosa son los más utilizados, siendo la tendencia hacia el gel de agarosa por una mayor resolución.3.5. Fotodensitómetro:El haz de luz del fotodensitómetro incide con el soporte donde se ha realizado la migración electroforética y con las diferentes fracciones de la muestra separadas; las bandas absorberán la luz en función de la densidad de color -cuantas más moléculas hay en cada banda, más densidad de color-. El detector recibe el haz de luz que ha atravesado cada banda- menor cuanto mayor sea su densidad de color- obteniendo un registro en forma de gráfica del recorrido del haz de luz.-.-.La altura de las bandas depende de la densidad de color y el ancho depende del ancho de la banda leída.—–.Calculando el área bajo la curva mediante integrales, nos da el porcentaje de concentración de cada una de las fracciones. Si introducimos en el fotodensitómetro la cantidad de proteínas totales determinadas mediante refractometría, por el método de Biuret o cualquier otro método, el fotodensitómetro nos determina la concentración de proteínas correspondiente a cada banda.3.6. Espectrofotómetro:Permite determinar la absorbancia de las bandas separadas mediante la electroforesis obteniendo el porcentaje de la concentración correspondiente. Si conocemos la cantidad de proteínas totales de la muestra, podemos calcular la concentración de proteínas migradas en cada una de las bandas

4. TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS:4.1. Electroforesis en papel: No está en uso 4.2. Electroforesis en acetato de celulosa cellogel: Es la técnica de rutina en el LAC por sus múltiples ventajas, económicas, fácil manejo etc. 4.3. Electroforesis en gel de agarosa: También muy utilizada en el LAC, entre las ventajas que presenta destacamos la inclusión de la muestra en el soporte -ej. determinación de anticuerpos-, la cantidad de suero utilizado -pequeña-, y tiempo de realización -corto-.4.4. Electroforesis en gel de almidón: En desuso por las dificultades de manejo del gel. 4.5. Electroforesis en gel de poliacrilamida: Separa por carga y tamaño.4.6. Isoelectroenfoque: Consiste en la separación de moléculas según su punto isoeléctrico. Es útil para la separación de sustancias anfóteras como las proteínas. Su principal ventaja es su gran poder de resolución que hace que puedan separase moléculas con puntos isoeléctricos muy cercanos. 5. REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE ELECTROFORESIS:Consta de las siguientes fases:Preparación de la muestra:-Hemoglobinas: Hemolizado de glóbulos rojos.-Proteínas: Suero reciente.Selección y preparación del soporte:2 tipos:– No restrictivos: Separan solo en función de la carga: papel, acetato de celulosa, gel de agarosa.-Restrictivos: La separación se realiza por la carga pero también por el tamaño del poro del gel que separa según el tamaño u características de la partícula: gel de almidón, gel de poliacrilamida (mejor separación).Aplicación de la muestra, sobre:-Superficie o soporte-Orificios o ranuras en los geles(inmunoelectroforesis)-Inclusión de la muestra en el gel en el proceso de polimerización.Electroforesis de zona:Revelado:Tiene por objeto la localización, para su posterior evaluación, de las distintas fracciones en que ha sido separada la muestra.-.-.Consta, normalmente de 3 fases:Coloración, decoloración y transparentación.-.-.Colorantes usados en la tinción según la muestra a separar:Proteínas: Ponceau S, Negro Amido, Azul brillante de Comasie.Lipoproteínas: Negro sudan B, Azul brillante de Comasie.Glucoproteinas: PAS(ácido periódico-Schiff.Enzimas : deshidrogenasas: NADH (fluorescencia).estearasas: esteres de B-naftol.fosfatasas: alfa-naftilfosfato.Lectura y cuantificación:El informe se da en % de cada fracción con respecto a cantidad de la sustancia analizada.Hay 2 formas de realizar la lectura y cuantificación:– ELUCIÓN: Recortar las zonas teñidas del soporte, eluirlo en un disolvente y después realizar la lectura en un espectrofotómetro. No necesita transparentado en el apartado anterior.– DENSITOMETRIA: Consiste en la lectura directa de las tiras mediante un aparato que se denomina fotodensímetro. Necesita transparentado de la tira.6. ASPECTOS PRÁCTICOS:6.1. Aplicaciones clínicas:Dependiendo de las moléculas a separar, los soportes utilizados son:Sustancias:Aminoácidos ,Proteínas séricas ,Lipoproteínas,Glucoproteínas,ácidos nucleícos ,Isoenzimas:-Lactotodeshidrogenasa-Creatininkinasa-Fosfatasas alcalinas,Inmunoglobulinas,Hemoglobinas. Soportes:Papel, acetato de celulosa,Acetato de celulosa, gel de poliacrilamida, gel de agarosa,Acetato de celulosa, agarosa,Agarosa,Agarosa,Agarosa-Agarosa,Azarosa, poliacrilamida, acetato de celulosa,Acetato de celulosa.6.2. Problemas con el tampón:Es importante vigilar el pH y la fuerza iónica del tampón y mantener constantes estos parámetros pues durante la electroforesis existe un proceso de electrolisis del agua que origina cambios en el pH. Si el volumen de tampón utilizado es pequeño, desechar, pero si es grande, se puede reutilizar en el siguiente proceso si cambiamos la polaridad de los electrodos o bien guardar el tampón mezclando el contenido en las dos cámaras en una botella a 4ºC hasta su nueva utilización. En cualquier caso no utilizar el tampón más de 2-3 veces. Por otra parte hay que evitar la contaminación bacteriana en el tampón por lo que es conveniente su refrigeración.6.3. Electroendosmosis:Consiste en un desplazamiento en sentido contrario debido a que los soportes, en su superficie, forman una nube iónica retrasando el movimiento de las partículas o incluso, llevándolas en sentido contrario. Este efecto se elimina trabajando con soportes cuya carga superficial sea mínima. 6.4. Aplicación de la muestra sobre la tira:Para respetar la cantidad de muestra que la técnica indica, se utilizan aplicadores que cogen un volumen determinado de muestra. Para su correcto empleo, poner una gota de suero en un vidrio de reloj o un porta y extender ligeramente. Seguidamente, poner en contacto el aplicador con la muestra llenándose esta por capilaridad.-.-.-.La aplicación de la muestra sobre la tira debe ser perpendicular a la misma y, la huella que aparece, debe reproducir la zona del aplicador puesta en contacto con la misma, es decir, rectangular. En general, para obtener una resolución óptima, la muestra situada sobre el soporte debe reunir las siguientes características:__Debe ser lo más estrecha posible.__Homogénea.__Contener la cantidad adecuada de muestra con lo que evitamos distorsiones en el trazado. 6.5. Voltaje y calentamiento:aumenta el voltaje, se produce un aumento de la temperatura que provoca la aparición de bandas arqueadas debido a la desecación de las zonas laterales del soporte produciéndose una migración más lenta en los bordes respecto al centro de la tira.7. SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA DE PROTEÍNAS SÉRICAS:7.1 Fundamento:Consiste en hacer pasar una corriente eléctrica a través de un soporte impregnado en una disolución amortiguadora de pH 8,6. Las proteínas, en medio básico, adquieren una carga global negativa que hace que emigren del cátodo (-) al ánodo (+), obteniéndose, si utilizamos como soporte acetato de celulosa, cinco fracciones correspondientes a las diferentes proteínas con cargas negativas decrecientes: – Albúmina ( la de menor peso y mayor carga negativa) – Alfa-1 globulinas – Alfa-2 globulinas – Beta-globulinas – Gamma globulinas ( las menos negativas) -.-.-.Si el soporte utilizado es gel de agarosa, las proteínas que emigran en la fracción de la beta-globulinas se dividen en dos bandas denominadas Beta-1 y Beta-2.7.2 Material:– Cubeta – Alimentador para electroforesis – Aplicador (macro/microaplicador) – Soporte: acetato de celulosa (cellogel). Las tiras deben conservarse en el mismo envase o en una solución de metanol al 30-40 % o en ácido acético al 80 % sino se van a utilizar antes de 3-4 días. – Pinzas – Recipientes para coloración, decoloración y transparentado. – Pipeta – Porta – Cristal – Tubo de ensayo.7.3. Reactivos:a) Solución tampón (Veronal sódico 0,04 molar, dietilbarbiturato sódico 8,24 gr/L).b) Colorantes :–Negro amido 10B ( 0,5 gr en 45 ml de metanol + 45 ml de agua + 10 ml de ácido acético)– Rojo Ponceau S .c) Eluyentes (decolorantes):–Solución acuosa de metanol-acético (47,5 ml de metanol+5 ml de ácido acético + 47,5 ml de agua destilada) si se ha teñido con negro amido.–Ácido acético al 5 % si se ha teñido con rojo Ponceau S.d) Líquido transparentador:Solución A: Metanol 87 mL + ciclohexanona 3 mL .Solución B: Ácido acético 10 mL. La mezcla tiene una duración aproximada de 10 días.7.4. Técnica:1. Preparación de la cubeta:–Cubeta limpia y seca:Se llena ambos lados de la cubeta con solución tampón sin que lleguen a entrar en contacto (debe ser suficiente para tocar los electrodos) aproximadamente 150 mL /3 tiras.–Tapar para evitar la evaporación.2. Preparación del soporte:–Se coge la tira por un extremo mediante las pinzas.–Comprobar la existencia de la marca que nos indica la cara absorbente -aspecto mate- (si no hay ninguna marca, realizar un corte en el extremo inferior derecho dejando hacia arriba la superficie mate).–Se sumergen completamente las tiras de cellogel en la solución tampón durante 10-15 minutos como mínimo; con ello se evita la formación de burbujas en la superficie que originarían manchas opacas sobre la tira.–Extraer las tiras de cellogel del tampón mediante unas pinzas y eliminar el exceso del mismo situándolas entre dos hojas de papel de filtro.–Se extienden las tiras sobre el puente de la cubeta comprobando que la superficie absorbente (mate) mire hacia arriba y que queden suficientemente tensas. Para ello, la esquina achaflanada de la tira debe situarse en la parte inferior derecha de la persona que realiza la electroforesis. Igualmente comprobar que los extremos de las tiras se encuentran en contacto con el tampón..–Tapar la cubeta y espesar de 3-5 minutos la estabilización de las tiras en el medio.3. Aplicación de la muestra (suero): –colocar una gota de la muestra sobre un portaobjetos o un vidrio de reloj con una pipeta Pasteur y extender ligeramente.–Poner en contacto el aplicador con la muestra; por capilaridad tomará la cantidad adecuada dependiendo de su tamaño (macro o microaplicador).–Situar el aplicador sobre el soporte a un centímetro del borde cercano al cátodo (-). Se tapa la cubeta.4. Migración electroforética: –Conectar la cubeta a la fuente de alimentación prestando especial atención a la posición del cátodo (-) color rojo, en la zona de la cubeta más cercana del lugar donde se depositó la muestra y el ánodo (+) y color negro en la zona más alejada.–Seleccionar la intensidad de la corriente: I = 0,1 A .-.Macroelectroforesis: 65 minutos a 200 V .-.-.Microelectroforesis: 35 minutos a 200 V .Desconectar el alimentador y las cubetas.5. Revelado: Tres fases:Fijación: Colocar el colorante elegido en un recipiente suficientemente grande que permita la extensión de la tira. Poner en contacto la superficie de la solución colorante con la cara absorbente de cada una de las tiras. Sumergir las tiras durante 5 minutos moviendo la cubeta para que el colorante impregne bien la totalidad de la tira.Decoloración: Colocar el decolorante en 3-4 recipientes con espacio y capacidad suficiente para la tira. Colocar las tiras en el primero de ellos y agitar. Ir cambiando a los otros recipientes hasta que las tiras ya no cedan color y únicamente se aprecien las bandas teñidas de proteínas. Eliminar el exceso de decolorante colocando las tiras entre dos hojas de papel de filtro. Transparentación: Situar las tiras en una cubeta con el líquido transparentador durante 1-2 minutos agitando la cubeta.6. Extender las tiras sobre una placa de vidrio eliminando las burbujas de aire mediante un rodillo o tubo de ensayo. La cara absorbente debe estar en contacto con el cristal.7. Calentar el vidrio con las tiras en una estufa hasta que la transparencia de las mismas sea completa (60-70ºC durante 3-4 minutos) o 1 hora a temperatura ambiente.8. Dejar enfriar hasta temperatura ambiente (30´) antes de retirar las tiras. Pueden conservarse transparentadas y secas. 7.5. Cuantificación: Podemos utilizar dos técnicas: a) Densitometría:Cortar la tira eliminando los extremos donde no se aprecia la presencia de bandas y colocarla sobre la superficie de vidrio del fotodensitómetro, procediendo a la lectura. Obtenemos un gráfico o proteinograma y los porcentajes de las proteínas presentes en cada banda de la tira mediante la determinación de las áreas bajo la curva de la gráfica obtenida. Si introducimos mediante el teclado del fotodensitómetro, la cantidad correspondiente a las proteínas totales determinadas por refractometría u otra técnica, el aparato cuantifica cada una de las fracciones proteicas en cantidades absolutas. Los valores normales de las proteínas séricas son:-Albúmina 37-56,4 gr/L ( 56-68 %) .Alfa-1 globulinas 0,6-3 gr/L (1,2-4,5 %) -Alfa-2 globulinas 4-10 gr/L (5-12 %) -Beta-globulinas 5-14 gr/L (8-14 %) -Gamma-globulinas 7,1-14,2 gr/L (12-18 %) -.-.Si la muestra utilizada es plasma, el fibrinógeno migrará entre las fracciones beta y gamma.