1. Clasificación de los Inmunoensayos

Existen diferentes clasificaciones:

A. En función de la necesidad de separar las fracciones ligada y libre.

1. Heterogéneos.
2. Homogéneos.

B. En función de la disponibilidad del reactivo.

1. Competitivos.
2. No competitivos.

C. Según el tipo de marcador.

• Moléculas radiactivas: radioinmunoensayos.
• Moléculas fluorescentes: Fluoroinmunoensayos e inmunofluorescencia.
• Enzimas: enzimoinmunoensayos.
• Compuesto que produce luz: inmunoensayos/Quimioluminiscentes.
• Macropartículas que se unen al compuesto de interés: Inmunocromatografía.

1.2 Representación de Datos y Obtención de Resultados

1. Expresión del valor medido mediante un formato normalizado: ensayos protocolarizados.

• Se mide la absorbancia de una sustancia patrón y el resultado en porcentaje.
• + a partir de un cierto valor y negativo sino se supera dicho valor.
• Índice de cut off: COI = DO Muestra/ DO Estándar.

2. Obtención del resultado por extrapolación en una curva patrón:

• Se realiza una curva patrón de referencia utilizando sueros control (calibradores).

1.3 Sistema de Amplificación de Señales

Esta técnica utiliza Ag o Ac unidos a una enzima. Ninguno ve alterada sus propiedades.

• Enzimas que se utilizan: Fosfatasa alcalina, Peroxidasa e Incluyen a veces el uso de Avidina-Biotina.
• Además, permite amplificar la reacción Ag-Ac.

Las principales características que debe poseer la enzima utilizada son:

• altamente purificado y obtenerse de forma económica,
• poseer una actividad específica,
• no debe estar presente en los líquidos biológicos.

1.4 Ventajas

• Enzima no se altera durante la actividad.
• Cataliza la reacción de muchas moléculas, amplifica la reacción y mejora la detección.
• El uso de Ac monoclonales ha contribuido a aumentar la especificidad.
• Los Ac conjugados con la enzima son estables y pueden almacenarse durante un tiempo relativamente largo.
• La formación de un producto final coloreado permite la observación directa de la reacción o la lectura espectrofotométrica automatizada.

2. Enzimoinmunoensayos (EIA)

Esta técnica utiliza Ag o Ac unidos a una enzima. Ninguno de ellos ve alterada sus propiedades inmunológicas o enzimáticas.

1. EIA homogéneos:

• La reacción Ag-Ac es el modulador de la actividad enzimática que se puede medir sin necesidad de separar los componentes marcados enzimáticamente, de los no marcados.
• Existen varios tipos, el más empleado se denomina EMIT (técnica de enzimoinmunoanálisis multiplicado) que utiliza la capacidad inhibitoria que ejerce el Ac cuando se une al conjugado Ag-enzima.
• Se utiliza para la determinación de hormonas, medicamentos o drogas (Ag).
• Reacción en medio líquido.
• Competencia entre el Ag libre presente en la muestra analizada y el Ag marcado enzimáticamente.

Cuando el Ag marcado forma un inmunocomplejo, la enzima que lleva unida se inactiva. Cuando el Ag marcado no se combina, la enzima se mantiene activa generando un producto coloreado. Resultado indirectamente proporcional a la concentración de Ag libre en la muestra estudiada.

2. EIA heterogéneos, inmunoensayo en fase sólida: requiere un paso previo de separación de los complejos Ag-Ac.

• Cuando el proceso de separación se realiza por la utilización de un Ag o un Ac fijado a una fase sólida este método recibe el nombre genérico de ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas).
• La técnica ELISA se basa en la fijación de uno de los componentes de la reacción inmunológica (Ag o Ac) a un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida (líquido a evaluar), si contiene el reactivo complementario (Ag o Ac), se forman complejos inmunológicos Ag-Ac que son estables.
• Posteriormente agregamos un sustrato cromogénico de la enzima marcadora, que produce la hidrólisis del sustrato.
• Se produce un cambio de color.
• La existencia de una reacción inmunológica se demuestra y se cuantifica midiendo espectrofotométricamente la cantidad de producto enzimático resultante.

ETAPAS. (ELISA).

1. Tapizado: fijación al soporte de Ac o Ag. Se diluyen en tampón carbonato a pH 9,6 y se incuba durante 3 horas a 37ºC o a 16 horas a 4ºC.
2. Bloqueo o posttapizado: se añade una proteína irrelevante para evitar fijaciones inespecíficas.
3. Conjugación del Ac o del Ag con una enzima: se usa glutaraldehído o el peryodato sódico.
4. Incubación y lavados: como solución de lavado se suele utilizar solución salina o PBS con Tween 20.
5. Unión del Ag o del Ac a los pocillos. Se realiza con gran facilidad porque la superficie de los pocillos ha sido tratada para tener gran afinidad por diferentes moléculas.
6. Después de un lavado para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos.
7. Se añade el sustrato enzimático cromógeno y se deja reaccionar.
8. Se añade una sustancia de frenado.
9. Se lee espectrofotométricamente.

VENTAJAS DEL ELISA.:

• Fácil y versátil, simple en su realización.
• Presenta mayor sensibilidad que la obtenida por otras técnicas.
• Permite analizar muchas muestras de suero de forma simultánea.
• Aparece dondequiera que esté la enzima, detectándose incluso cantidades muy pequeñas de muestra (menor de 1 ng/ml) debido al carácter amplificador de la reacción.
• La detección con instrumentos elimina el elemento de subjetividad común en otros procedimientos serológicos.

DESVENTAJAS DEL ELISA:

• Necesidad de contar con un equipo especial,
• Tiempos de reacción bastantes prolongados,
• mediación de la cantidad del producto final no depende de la reacción original sino de una segunda reacción enzimática,
• Necesidad de realizar varias determinaciones juntas para que la prueba sea rentable.

USOS DEL ELISA. Determinación de: Ac contra los agentes causantes de enfermedades bacterianas, micosis, parasitosis y procesos virales incluidos la Hepatitis B y el VIH, Hormonas y marcadores tumorales…

3. Inmunoensayos Quimioluminiscentes

. Utilizan sustratos quimioluminiscentes que emiten luz cuando se da la reacción enzimática. La emisión quimioluminiscente se mide mediante un espectrofotómetro de quimioluminiscencia molecular o luminómetro.  Es una técnica más sensible que la reacciones colorimétricas. Los marcadores quimioluminiscentes son compuestos químicos que emiten luz cuando son oxidados por peróxidos en presencia de algunos catalizadores. Algunos de los más habituales son: Luminol, Ester acridinio, Lucigenina.

3.1 INMUNOENSAYO MAGNÉTICO QUIMIOLUMINISCENTE (CMIA). Se basa en el aislamiento de los complejos antígeno-anticuerpo sobre la superficie de fase sólida de pequeñas esferas denominadas micropartículas magnéticas. Es una técnica muy sensible.  Se utiliza de forma automatizada. Se usa en la detección de: Factor reumatoide, Proteína C reactiva, Monitorización de las concentraciones plasmáticas de fármacos. Utiliza un formato sándwich no competitivo, por lo que la intensidad de señal medida es directamente proporcional a la concentración del analito de la muestra. Peculiaridades: Emplea micropartículas magnéticas, Separación mediante un imán, Lectura con un tubo fotomultiplicador de quimioluminiscencia.

4. FLUOROINMUNOENSAYOS. inmunoensayos que utilizan como marcadores sustancias capaces de emitir fluorescencia. La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas moléculas de absorber energía a una longitud de onda entre los 200-400 nm (espectro ultravioleta) y la emite a una longitud de onda entre 400-700 nm (espectro visible). 2 técnicas: INMUNOFLUORESCENCIA: se basa en la detección de Ag de superficie de células o tejidos presentes en el suero o en los tejidos del paciente mediante su reacción con un Ac marcado con un fluorocromo. El Ac se une covalentemente al fluorocromo y esta unión no altera la actividad inmunológica del Ac. Pruebas muy utilizadas para detectar Ag. Los determinantes antigénicos se inmovilizan y fijan sobre portaobjetos de vidrio. Se aplican a la muestra Ac monoclonales o policlonales conjugados (ligados) con colorantes fluorescentes. Examen con microscopio de fluorescencia (espectrofluorimetro).  Dos fluorocromos más utilizados son: Isocianato de fluoresceína (FITC) que da una fluorescencia verde. Rodamina: que da una fluorescencia rojo anaranjado. Esta técnica permite el diagnóstico rápido de infecciones microbianas. La muestra requiere la inactivación de los Ag para lo que las muestras de los tejidos deben congelarse inmediatamente en nitrógeno líquido y conservarse a -70ºC. Dos tipos: Inmunofluorescencia directa (IFD): Se marca con un fluorocromo el Ac específico contra el Ag que se busca y se les hace reaccionar en condiciones óptimas. Después se lava para eliminar el exceso de Ac que no ha reaccionado y se procede a la lectura de los resultados. Récnica sencilla y rápida de realizar, pero de coste elevado. Inmunofluorescencia indirecta (IFI): reacción en tres etapas: 1. Reaccionar el Ag con su Ac específico sin marcar. Para ello se adhiere el antígeno contra el que el paciente ha formado anticuerpos a la superficie de un porta. 2. El suero del paciente se coloca sobre el portaobjetos. Si hay Ac en el suero se unirán a su Ag específico. El Ac no unido se elimina luego mediante lavado de porta. 3. Se agrega un conjugado de antiglobulina humana (que puede estar dirigida de forma específica contra IgG o IgM) marcado con fluorocromo que se unirá al Ac adicionado en la primera fase por la fracción Fc. Detector de la unión del Ac al Ag cuando se observe en un microscopio de fluorescencia.  FLUOROEZIMOINMUNOENSAYOS (FEIA). Se parte de especies no fluorescentes, a partir de las cuales se obtiene un producto enzimático fluorescente. Se detecta en un equipo denominado fluorímetro. Método ELFA: técnica ELISA sándwich con lectura final en fluorescencia. La fluorescencia es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra. Se utilizan métodos automáticos muy rápidos que permite medir varias muestras y varios parámetros. Cuando se utiliza una matriz plástica recubierta de alérgenos se denomina sistema CAP y se utiliza para la detección de IgE. Se utilizan anti-IgE marcados con b-galactosidasa. Enzimoinmunoensayo microparticulado (MEIA): aislamiento de los complejos Ag-Ac sobre la superficie de fase sólida de pequeñas esferas denominadas micropartículas. Se utilizan Ac específicos de las moléculas problema marcados con la enzima fosfatasa alcalina. Se añade el sustrato que se hidroliza y se obtiene una molécula fluorescente. Se puede automatizar y sirve para medir marcadores tumorales, hepáticos… Componentes de la técnica: 1. Fase sólida: Micropartículas de látex recubiertas de Ac específicos para el analito (molécula problema que se quiere detectar). 2. Conjugado: Ac específicos de la molécula marcados con enzima. 3. Sustrato. Procedimiento: 1. Incubar las micropartículas de látex con los Ac, con la muestra que queremos analizar. Si son complementarios se unirán a ellos. 2. Se añade la mezcla sobre una matriz de fibra de vidrio, que sirve para fijar los complejos antígeno-anticuerpo. 3. Se añade el conjugado. Si el analito está presente en la muestra, los conjugados se unirán, formando el sándwich. 4. Al añadir el sustrato reaccionará emitiendo una luz fluorescente.

RADIOINMUNOENSAYO. Usan como marcadores isótopos radioactivos (inestables) que experimentan procesos de desintegración radiactiva para dar lugar finalmente a isótopos estables. La molécula marcada se denomina trazador. Marcadores isotópicos: Internos (14C, 3H) Externos (125I). Consiste en enfrentar la sustancia buscada en la muestra problema a una molécula marcada con un radioisótopo y proceder a la lectura de los resultados obtenidos mediante el recuento de la radiactividad desprendida del complejo formado. Los radioisótopos más utilizados pueden emitir radiaciones BETA como el tritio aunque se utilizan más frecuentemente los que emiten radiaciones GAMMA entre los que destaca el Yodo 125. En el marcaje de la molécula con Yodo, este se incorpora a los aminoácidos aromáticos: tiroxina, fenilalanina, triptófano o histidina. Es una técnica heterogénea, es decir, requiere para el análisis de la radiactividad que previamente se proceda a la separación de las moléculas marcadas que se han unido a los complejos inmunes (fracción ligada) de las que no están fijadas (fracción libre). Esta separación se puede realizar de diferentes maneras: · Precipitar la fracción ligada y dejar en disolución la fracción libre. ·Adsorción de la fracción libre a productos como el carbón activado o al talco. · Recubrir un soporte sólido (tubo o pocillos de una placa) con Ag o Ac al que van a unirse los reactivos marcados con el radioisótopo. Tras ello la fracción libre se elimina fácilmente mediante lavado. Es el método más utilizado. (Determinación en fase sólida). Detectores: Detectores de ionización y Contador de centelleo. La radiactividad se mide en cuentas por minuto (CPM). Características: Muy sensible, Aparatos costosos, Un riesgo para la salud de los que la realizan.

RIA de competición: El RIA se basa en la competencia existente por el Ac, un Ag sin marcar y una cantidad conocida del Ag* marcado para formar los complejos Ag-Ac o Ag*-Ac. Manteniendo constante la cantidad de Ag* y Ac se observará que, a mayor cantidad de Ag en la muestra, menos Ag* queda unido a la cantidad fijada de Ac (y por tanto menos radiactividad presenta), lo que permitirá relacionar la radiactividad con la concentración de Ag.

RIA indirecto o en fase líquida: 1. Se inmoviliza una cantidad constante de Ag en un soporte sólido, que puede ser un tubo o una placa de plástico, y se lava para eliminar el exceso de Ag. 2. Se adiciona la muestra problema en la que se quieren determinar los Ac. Y se lava para eliminar lo que no se haya unido. 3. Se añade una cantidad constante de Anti-anticuerpo marcado (conjugado). Y se vuelve a lavar para eliminar lo que no se haya unido. 4. Se mide la radioactividad en la placa, con un contador.

IRMA. 1. Se inmoviliza una concentración fija del Ac (no marcado) en un soporte sólido, tras lo que se satura el soporte. 2. Se añade la muestra problema (o de calibrado) de Ag. 3. Tras esto, se añade el Ac* (marcado) que se una a otro epítopo del Ag. Se lava para eliminar el Ac* no unido.4. Se determina la cantidad de Ac marcado unido. 5. A partir de una recta patrón se interpola el valor obtenido para saber la concentración de Ag presente. También puede hacerse con la recta de calibrado.

RIST. Variante del RIA. Se utilizan para la detección de IgE totales. Como soporte se utiliza un disco de papel se denomina PRIST. Es un radioinmunoanálisis de competición para la detección de IgE séricas totales. La reacción sigue el siguiente esquema: ijación de Anti-IgE sobre un soporte sólido y lavado posterior para eliminar los restos que no se hayan unido. Adición de la muestra de suero que contiene las IgE y de IgE*. Ambas IgE e IgE* compiten por unirse. Cuanto más IgE haya en el suero menos IgE* se unirá. Obtenemos los resultados a partir de una curva patrón previamente realizada.

RAST. Variante del RIA. Detecta IgE específicas. Mide la IgE antígeno específica. Su fundamento es similar al ELISA indirecto. Los pasos son idénticos a los de RIA básico en fase sólida, salvo que el Ag (en este caso el alérgeno) se une a un disco de celulosa en lugar de hacerlo sobre una placa. La disponibilidad de muchos más Ag sobre el disco permite la sensibilidad necesaria para unir las pequeñas cantidades de IgE específicas presentes en el suero problema.

6. INMUNOCROMATOGRAFÍAS. técnica muy sencilla para la detección de todo tipo de proteínas de carácter antigénico. Es rápida y fiable. Se emplea como método de screening de forma que las pruebas que resultan positivas se confirman con otra prueba analítica que valide el diagnóstico. Se puede usar con todo tipo de muestras: sangre completa, suero, heces, orinas… La preparación de la muestra es sencilla. Tipo de inmunoensayo en que se usan como marcador nanopartículas coloreadas (oro: color rosa, selenio, color azul). La prueba utiliza como soporte una tira de nitrocelulosa, podemos distinguir varias zonas: 1. Zona de siempre de la muestra. 2. Zona de conjugado. 3. Zona de detección. 4. Zona de control. 5. Región absorbente.

6.1 INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA DETECCIÓN DE ANTÍGENOS. muestra con el Ag en la zona de siembra de la tira de nitrocelulosa. Dejar que la muestra fluya por capilaridad: 1. Llega a la zona en la que se encuentra inmovilizado el conjugado (Ac específico marcado). Al llegar el Ag se formarán inmunocomplejos. 2. Siguen migrando por la tira de nitrocelulosa hasta la zona de detección, en la que se hallan fijados Ac específicos contra otro epítopo del Ag. Los inmunocomplejos quedan fijados a los Ac formando una banda coloreada rosa o azul. 3. La muestra sigue fluyendo por capilaridad hasta la zona de control. El exceso de conjugado será capturado por un Ac anticonjugado y se formará una banda coloreada.

6.2 INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS. Zonadelconjugado esta inmovilizado un Ag especifico marcado (conjugado). Zona de detección se encuentra fijado un anticuerpo anti-Ig que captura los complejos inmunes formados con el Ag marcado. Zona de control se encuentra fijado un Ac específico para el Ag marcado que captura el exceso de este. Indica que la prueba ha sido realizada correctamente.

7. TÉCNICAS DE INMUNOELECTROBLOT. Mediante esta técnica se obtiene un Ag separado e inmovilizado en una membrana para evitar la difusión del Ag lo que le hace más fácilmente accesible para su identificación. Es una técnica muy sensible que permite identificar Ags y Acs. Se basan en la separación electroforética de proteínas en geles de poliacrilamida, la transferencia blotting de dichas proteínas a un soporte solido (membrana de nitrocelulosa o nylon) y la posterior detección de una o más bandas identificadas por Acs específicos. Así, la técnica permite investigar la presencia de un antígeno dado en una mezcla de proteínas presentes en una determinada muestra y para ello disponer del Ac específico para marcar la membrana. La fijación de las proteínas a las membranas se puede llevar a cabo a partir de soluciones proteicas complejas (método de las manchas o DOT-ELISA) o de proteínas separadas previamente por electroforesis en geles y transferidas a continuación a membranas (Western blot).

7.1 DOT-ELISA O MÉTODO DE LAS MANCHAS. método sencillo que permite fijar gran cantidad de proteínas a las membranas de nitrocelulosa. Se siembra sobre la membrana de nitrocelulosa unas gotas de la solución antigénica. PASOS: 1. Depositar sobre la membrana de nitrocelulosa una pequeña gota de Ag y dejar secar bajo una lámpara. 2. Bloquear la membrana con proteína irrelevante y lavado. 3. Sumergir la membrana en una solución de la muestra problema sospechosa de contener Ac. Incubar, eliminar la solución y lavar la membrana. 4. Sumergir la membrana en una solución de Ac marcado con enzima. Incubar, eliminar la solución y lavar la membrana. 5. Sumergir la membrana en una solución de sustrato que de un producto final coloreado que precipita en la membrana sobre el lugar de reacción. 6. Recuperar la membrana y realizar la lectura. Si en la muestrea había Ac en la zona de sembrado del Ag se observa una coloración.

7.2 WESTERN-BLOT: combinación de teres técnicas analíticas: Separación mediante electroforesis de los componentes del Ag en geles de poliacrilamida. Electrotransferencia o electroblotting de los componentes del Ag desde los geles a membranas inmovilizantes. Identificación principalmente mediante enzimoinmunoensayo con Ac conocidos. PASOS: 1. Solubilización del Ag: con ella se consigue la ruptura del Ag en componentes polipeptídicos de distintos pesos moleculares que contienen los epítopos del Ag y los mantienen activos. 2. Preparación de los geles de poliacrilamida: estos geles están formados por monómeros de acrilamida y bisacrilamida. 3. Separación electroforética del Ag en el gel: una vez preparado el gel, se realizaren unos pocillos y se aplicara la muestra. 4. Se rellenara la cubeta de electroforesis con el tampón adecuado y se aplicara el campo eléctrico para que migren los distintos componentes del Ag. 5. Electrotransferencia del Ag a un soporte de membrana. Se suele utilizar membrana de nitrocelulosa. 6. Bloqueo de los sitios de unión de proteínas libres en la membrana. 7. Enzimoinmunoensayo o radioinmunoensayo: para detectar Ac en muestras de suero problema o para identificar bandas antigénicas específicas con antisueros conocidos. Se suele utilizar para revelado anti-IgG marcado con enzima.