Técnicas Bioquímicas para la Identificación Bacteriana
A- INTRODUCCIÓN
La rápida y correcta identificación del microorganismo o microorganismos presentes en el agua o causantes de un brote epidémico es importante para la implantación del tratamiento adecuado de una enfermedad, para saber el origen de la contaminación, aplicar las medidas correctoras y evitar en el futuro que se vuelva a producir. De ahí la importancia de las pruebas que se seleccionen para llegar a dicha identificación.
B.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS
El método más extendido para llegar a la identificación de microorganismos se basa en la realización de una batería de pruebas bioquímicas, a través de las cuales se va a detectar el metabolismo del microorganismo, enzimas que posee, características de resistencia a determinadas sustancias, etc… La identificación es tanto mejor cuanto mayor es el número de caracteres estudiados.
Para realizar correctamente las pruebas bioquímicas es fundamental tener colonias perfectamente aisladas, es decir, partir de cultivos puros. Por otro lado, se debe realizar un control periódico de medios y reactivos mediante el empleo de microorganismos positivos y negativos.
1.- PRUEBA DEL INDOL
Fundamento:
Se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima triptofanasa o triptofanodesaminasa, capaz de desdoblar el triptófano (aminoácido) en indol más alanina. Se detecta la presencia de esta enzima mediante la reacción del indol producido con el reactivo p-dimetilaminobenzaldehido.
Medio de cultivo: Agua de peptona:
- Peptona…………. 10 g
- Cloruro sódico….. 5 g pH = 7
- Agua destilada….. 1.000 ml
Reactivo: Reactivo de Kovacs:
- alcohol amílico o isoamílico o butílico… 75 ml
- p-dimetilaminobenzaldehido…………… 5 mg
- HCl concentrado……………………….. 25 ml
Técnica:
Sembrar con asa de platino el medio con el microorganismo objeto de estudio (tubos de hemólisis). Incubar a 37ºC durante 24-48 horas.
Lectura e interpretación de resultados:
Se agregan unas gotas del reactivo de Kovacs directamente sobre el tubo incubado y se agita. En caso de que la prueba sea positiva, es decir, en caso de que se haya producido indol, éste reaccionará con el p-dimetilaminobenzaldehido, apareciendo un anillo de color rojo en la superficie del tubo. El HCl tiene como función bajar algo el pH, favoreciéndose así la reacción, y el alcohol amílico concentra el color en la superficie.
2.- PRUEBA DEL ROJO DE METILO
Fundamento:
Mediante esta prueba se va a comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Es una prueba cualitativa para la producción de ácidos y requiere microorganismos que produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico), a partir de la glucosa, por la vía de fermentación ácido mixta.
Todos los miembros de las Enterobacteriaceas son, por definición, fermentadores de la glucosa. En el caldo RM/VP, después de 18-24 horas de incubación, la fermentación resultante da productos secundarios metabólicos ácidos; por lo tanto inicialmente todas las enterobacterias darán una reacción RM[+]. Sin embargo, después de más tiempo de incubación, como lo exige la realización de la prueba (2-5 días), aquellos microorganismos que son realmente RM[+] continúan produciendo más ácidos y dan como resultado un bajo pH terminal, venciendo al sistema amortiguador de fosfato y manteniendo un medio ácido (pH 4,2 o menos).
Aquellos microorganismos que presenten la prueba RM [-] continúan metabolizando los productos iniciales de la fermentación, produciendo compuestos neutros, elevando el pH hacia la neutralidad (pH=6 o más).
Medio de cultivo: Medio de Clark y Lubs (caldo RM/VP)
- Peptona………………………………. 7 g
- Fosfato bipotásico (K2HPO4)………… 5 g pH = 7
- Glucosa………………………………. 5 g
- Agua destilada……………………….. 1.000 ml
Se reparte el medio en tubos de hemólisis (2,5 ml. por tubo aproximadamente).
Reactivo:
Se utiliza solución alcohólica al 0,2% de rojo de metilo.
Técnica:
Sembrar con asa el medio líquido con el microorganismo objeto de estudio e incubar a 371C de 2-5 días.
Lectura e interpretación de resultados:
Después de dos días de incubación se añaden unas 5 gotas de reactivo al medio, observándose un viraje a rojo si es positivo y una coloración amarilla si es negativa. Si aparece un color anaranjado indica una reacción retardada. Tanto si la prueba es negativa como si aparece el color anaranjado se continuará la incubación hasta 5 días y se repetirá la prueba. Si continúa color amarillo o anaranjado será prueba negativa.
Se ha desarrollado una microtécnica rápida (método de Barry) que ha permitido disminuir el período de incubación con relación al método común (2-5 días). Se ha demostrado que, utilizando menores volúmenes de caldo para la prueba, los microorganismos en estudio sufrían una mejor exposición al oxígeno atmosférico, que hacía que los microorganismos RM [-] revirtieran al pH neutro inicial con mayor rapidez.
3.- PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
Fundamento:
Observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía butanodiólica. Si es así, se forma un producto intermedio (acetoina) que forma un complejo de color rojizo con el α-naftol.
Medio de cultivo: Medio de Clark y Lubs o lo que es lo mismo caldo RM/VP.
Reactivos:
- α-naftol al 5% en alcohol absoluto.
- KOH al 40%.
Técnica:
Sembrar el medio (en tubos de hemólisis) e incubar de 24 a 48 horas a 371C.
Lectura e interpretación de resultados:
Según el volumen de medio se añade un volumen determinado de la solución de α-naftol y de la de potasa (0,6 ml y 0,2 ml respectivamente cuando el tubo contiene unos 2 ml de medio).
Se agita para exponer el medio al oxígeno atmosférico para que se de la reacción:
- coloración rosa-rojiza en menos de una hora: VP [+]
- color amarillo en la superficie del medio: VP [-]
4.- PRUEBA DE LA UTILIZACIÓN DE CITRATOS
Fundamento:
Mediante esta prueba se determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono.
El medio incluye citrato de sodio como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato como única fuente de carbono también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoníaco, llevando a la alcalinización del medio. El medio lleva un indicador, el azul de bromotimol, que es amarillo a pH ácido, verde a pH neutro y azul a pH alcalino.
Medio de cultivo: Medio de citrato de Simmons:
- Monofosfato de amonio…………… 1 g
- Fosfato bipotásico…………………. 1 g
- Cloruro sódico…………………….. 5 g
- Citrato de sodio…………………… 2 g pH=7
- Sulfato de magnesio………………. 0,2 g
- Agar-agar………………………….. 17 g
- Azul de bromotimol………………. 0,08 g
- Agua destilada…………………… 1.000 ml
El medio se reparte en tubos de ensayo y una vez estériles se inclinan en pico de flauta.
Técnica:
Sembrar en pico de flauta el microorganismo obtenido en
medio sólido (los caldos pueden
aportar elementos nutritivos que pueden falsear los resultados), procurando no tocar con el asa el
medio, porque sustancias nutritivas de éste podrían igualmente falsear los resultados. Incubar a
371C de 24-48 horas.
Lectura e interpretación de resultados:- Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta tras
24-48 horas de incubación.
– Prueba negativa: no se observa crecimiento ni cambio de color (el medio
permanece de color verde).Si se observa crecimiento sin cambio de color, se confirmará la positividad de la prueba
incubando el tubo 24 horas más, durante las que suele aparecer el color azul.
INTERÉS:
las cuatro pruebas descritas constituyen el IMViC y sirven, junto con otras pruebas para la
diferenciación de los géneros de las Enterobacteriaceas.5.- PRUEBA DE LA CATALASA.
Fundamento: se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima catalasa, capaz
de descomponer el peróxido de hidrógeno o agua
oxigenada (H2O2 ) en H2O y O2 , que se desprende en
forma de burbujas en el medio. El H2O2 se forma
como un producto terminal oxidativo de la
descomposición aeróbica de los azúcares; si se
acumulara sería tóxica para la bacteria.
Reactivo: H2O2 de 10 volúmenes (3%).
Técnica:
A.- Método del portaobjetos: es el más
utilizado:
1. – Con un asa o hilo de inoculación,recoger el centro de una colonia pura de 18-24
h. y colocarla sobre un portaobjetos limpio.
2.- Agregar con un gotero o una pipetaPasteur una gota de agua oxigenada de 10volúmenes sobre el microorganismo del
portaobjetos.No invertir el orden del método puespueden registrarse falsos si se utilizan hilos o asas quecontengan hierro. Si se están utilizando asas hilos de platino también se puede caer en esteerror ya que el platino puede producir unresultado falsamente positivo. El nicrom noocasiona estos problemas. No es necesaria la
mezcla del cultivo y el agua oxigenada con laaguja o el asa de inoculación.
3.- Si el microorganismo es catalasa [+] se
observará de inmediato la aparición de burbujas
(liberación de gas). Registrar el resultado.
4.- Desechar el portaobjetos poniéndoloen un desinfectante.
B.- Método en tubo de ensayo:
1.- Disponer de un tubo con H2O2 al 3 %.
2.- Seleccionar la colonia a estudiar con un asa. Introducirla a continuación en el tubo conagua oxigenada.
3.- Observar la formación de burbujas y anotar el resultado.6.- PRUEBA DE LA OXIDASA.
Fundamento: se investiga la presencia de la enzima citocromooxidasa en el
microorganismo, la cual oxida al dimetil-parafenilen-diamina (reactivo incoloro) dando un producto
de color.
Reactivos: Dimetil-p-fenilendiamina o tetrametil-p-fenilendiamina impregnado sobre tiras o
discos de papel de filtro.
Técnica. Lectura e interpretación de resultados:
1.- Colocar una tira o disco impregnado de reactivo en un porta.
2. Tomar una colonia con el asa y depositarla sobre la tira o disco.
3.- La aparición de un color azul oscuro indica la existencia del enzima citocromooxidasa
(prueba positiva).Interés: ayuda a la identificación de los géneros Pseudomonas (por lo general positivo) de
las Enterobacterias [-], entre otros.
9.- PRUEBA DE LA β-GALACTOSIDASA (ONPG).
Fundamento: demostrar la presencia en el microorganismo de la enzima β-galactosidasa,
utilizando el orto-nitro-fenil-β-D-galacto-piranósido (ONPG).
Si el microorganismo posee esta enzima, el ONPG que es incoloro, es hidrolizado,
produciéndose orto-nitrofenol (ONP) que presenta una coloración amarilla cuando se encuentra en
solución neutra o alcalina; en condiciones ácidas es incoloro.
Los microorganismos fermentadores de la lactosa poseen dos enzimas: la enzima permeasa
(que regula la entrada de la lactosa en la bacteria) y una enzima β-galactosidasa (que desdobla la
lactosa en glucosa más galactosa). Los microorganismos que fermentan la lactosa poseen las dos
enzimas; los no fermentadores carecen de ambas enzimas. Hay microorganismos denominados
“
fermentadores tardíos de la lactosa” que poseen la β -galactosidasa, pero no la permeasa. Cuandose utiliza una determinada concentración de lactosa, estos microorganismos producen durante
cierto período de tiempo (48 horas a varios días o semanas) algunas células mutantes que poseenpermeasa, observándose la fermentación tardía de la lactosa, lo que indica que poseen la enzima β-galactosidasa.Medio de cultivo: caldo ONPG:
– agua de peptona (esterilizada a 121 C durante 15 minutos)….. 75 ml
– solución ONPG (0,6 g de ONPG en 100 ml de Na2 HPO4 0.01M, esterilizada por filtración
y añadida en condiciones asépticas al agua
de peptona………………………………………………… 25 ml
Este caldo se distribuye asépticamente en tubos estériles, 0,5 ml por tubo.
El ONPG se puede encontrar comercialmente impregnado en discos.
Técnica:
* Mediante la utilización de discos de ONPG:
– Realizar una suspensión bacteriana densa del microorganismo objeto de estudio en un
tubo que contenga unos 0,5ml de S.S.F. estéril.
– Colocar en el tubo un disco de ONPG.
– Incubar a 371C desde 1-24 horas, dependiendo del inóculo.
Lectura e interpretación de resultados:
– prueba [+]: aparición de un color amarillo estable por liberación del o-nitrofenol.
–
prueba [-]: incoloro después de 24 horas.
A la hora de hacer la lectura hay que tener en cuenta el pH dada la influencia que
tiene en la aparición del color amarillo. En caso de un aparente resultado [-] se puede alcalinizar
ligeramente el medio para comprobar que no se trata de un falso resultado negativo.10.- PRUEBA CON AGAR HIERRO DE KLIGLER.
Fundamento: mediante esta prueba vamos a poder determinar:
a) La capacidad de un microorganismo de atacar un hidrato de carbono específico (en estecaso glucosa, lactosa o ambas) incorporado en un medio de crecimiento básico.
b) Producción o no de gases: CO2 en H2 como productos finales del metabolismo de los
hidratos de carbono.
c) Producción de ácido sulfhídrico (SH2).
El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la lactosa. Existe otromedio, el TSI, que posee un tercer hidrato de carbono, la sacarosa; los fundamentos bioquímicos de
ambos son los mismos, por lo que nos vamos a referir solamente al medio de Kligler.
Medio de cultivo: Agar hierro de Kligler:
– Extracto de carne………. 3 g.
– Extracto de levadura…… 3 g. Peptona…………………. 20 g.
– Cloruro sódico…………. 5 g. Lactosa…………………. 10 g.
Glucosa………………… 1 g. pH=7,4
– Sulfato ferroso…………. 0,2 g. Tiosulfato sódico………. 0,3 g.
– Rojo fenol……………… 0,05 g.
– Agar-agar………………. 15 g.
– Agua destilada………….1000 ml.
Como podemos observar, la lactosa está presente en una concentración 10 veces superior a la glucosa.El sulfato de hierro se adiciona al medio para detectar la formación de SH2 por la bacteria,originándose sulfuro ferroso que es de color negro.
El indicador de pH rojo fenol es amarillo a un pH ácido, rojo a pH alcalino y anaranjado-rojizo a pH inicial del medio 7,4.El medio se reparte en tubos gordos, se esteriliza a 1121C durante 30min. y se dejará enfriar en planos inclinados y profundos, de modo que de toda la longitud del tubo que ocupa el medio solo 1/3 aproximadamentecorresponda al pico de flauta. Esta configuración hace que existanesencialmente dos cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción
inclinada, es aerobia; la porción inferior es relativamente anaerobia.
Técnica: la inoculación del medio se realiza con un hilo, tomando una
colonia aislada y sembrando en picadura hasta unos 0,6 cm. del fondo. Esta
distancia se debe respetar a fin de evitar la entrada de aire en la parte profunda
y una alteración en el medio anaerobio. Se retira el hilo por el mismo camino de
entrada y, sin volver a cargar el hilo, se siembra en estrías la superficie del pico
de flauta.Se incuban los tubos inoculados a 35-371C durante 18-24 h. Esimportante respetar estos tiempos de incubación, ya que lecturas de menor o mayor incubación
pueden dar resultados falsamente positivos o negativos.
Lectura e interpretación de los resultados:
a) Utilización de los hidratos de carbono:
1.- Fermentación de la glucosa y no de la lactosa: pico alcalino (rojo) y
fondo ácido (amarillo), K/A.
Si el tubo es inoculado con un microorganismo fermentador de la
glucosa y que no puede utilizar la lactosa, sólo se puede obtener una cantidad
relativamente pequeña de ácido, ya que la concentración de glucosa del medio
es de sólo un 0,1%. Inicialmente, durante las primeras 8-12 horas de incubación,
esta cantidad de ácido puede ser suficiente para hacer virar tanto el fondo
como el pico a color amarillo. Sin embargo, en las horas siguientes, consumida
toda la glucosa en el pico de flauta, las bacterias empiezan a utilizar las
peptonas para obtener nutrientes para su crecimiento, liberando amoníaco que
proporciona un pH alcalino al medio (color rojo en el pico). En el fondo del tubo
la degradación proteica es insuficiente para contrarrestar el ácido formado (los ácidos formados enausencia de oxígeno son más fuertes que en presencia de éste) y se mantiene el color amarillo.Ejemplo de no fermentadores de lactosa y sí de glucosa: Shigella, Proteus, Salmonella.Si el tubo se leyera después de 48 h. o más, tanto el pico como el fondo serían alcalinos. Los
ácidos producidos en el fondo, con el tiempo se oxidan.
2.-Fermentación tanto de la glucosa como de la lactosa: Pico ácido
(amarillo), fondo ácido (amarillo). A/A.
Las bacterias que utilizan la lactosa producen en el medio cantidades
relativamente grandes de ácido debido a la mayor concentración de lactosa en
el medio, quedando todo el medio amarillo a las 18-24 h de incubación. Si se
leyera el mismo tubo después de 48 h. o más, el pico de flauta se habría vuelto
alcalino por el agotamiento de la lactosa y utilización de las peptonas.
Ejemplos de microorganismos fermentadores de lactosa y glucosa son
Escherichia coli, Klebsiella y Enterobacter.
3.- No hay fermentación ni de glucosa ni de lactosa: Pico alcalino (rojo)
y fondo alcalino (rojo). K/K.En ausencia de fermentación de hidratos de carbono no se formanácidos, y la utilización de las peptonas con la consiguiente producción de gruposbásicos hace que todo el medio aparezca de color rojo. Las bacterias que
producen este tipo de fermentación son conocidas como “no fermentadoras” y
es una importante indicación de que el microorganismo no pertenece a las
Enterobacterias. Ej.: Pseudomonas aeruginosa (bacilo no Enterobacteriaceae
Gram (-)).
b) Producción de gas:
Los gases producidos son el CO2 y el H2, productos finales del
metabolismo de la glucosa. Se pueden apreciar por la aparición de burbujas en
la parte inferior del medio, por la producción de grietas en su interior o incluso
por la elevación del medio, que se separa del fondo.
c) Producción de ácido sulfhídrico (SH2).
El sulfhídrico es incoloro y su presencia se detecta a través de la
formación de sulfuro ferroso, que es negro. Debido a que se requiere un medio
ácido para que un microorganismo produzca sulfhídrico, un fondo negro debe leerse como ácido
aún cuando el color amarillo esté oscurecido por el precipitado negro.
Cuando se interpreta un resultado en el medio de Kligler puede observarse la combinación
de cualquiera de las reacciones características, debiendo anotarse de la siguiente manera:
a) Fermentación de hidratos de carbono: como ya se ha indicado.
b) Producción de gases: se registra con un círculo alrededor del símbolo que indica la acidez
o basicidad en la parte inferior del tubo.
c) Producción de SH2: se indica con una “S” junto al símbolo que indica la acidez o alcalinidad de la
parte inferior del tubo.
Interés: Se utiliza primariamente para identificar géneros de Enterobacterias.
C.- SISTEMAS MULTIPRUEBAS.
En los últimos años han aparecido en el mercado numerosos sistemas o equipos
multipruebas con el fin de facilitar la identificación de algunas bacterias, sobre todo
Enterobacterias, Estafilococos, microorganismos anaerobios y levaduras. Estos sistemas
proporcionan mayor comodidad y rapidez, pueden ser más baratos, pero no carecen de problemas
si se manejan de forma incorrecta. Todos exigen unas condiciones muy precisas de concentracióndel inóculo, de inoculación, de incubación y de lectura, que si no se observan pueden dar lugar aimportantes errores. Estos sistemas pueden ser manuales y automatizados.
SISTEMAS COMERCIALES MANUALES:
a) Sistema API:
Se trata de una tarjeta de material plástico dividida en pequeños pocillos que contienen
diferentes substratos deshidratados, en los cuales se inocula una suspensión del microorganismo a
estudiar.La lectura de los resultados se efectúa directamente, interpretando el color de cada
reacción, o tras la adición de reactivos reveladores. Con los resultados se establece un código
numérico que corresponde a una determinada especie reflejada en unas tablas.
Existe disponible para la identificación de Enterobacterias, Estafilococos, Estreptococos,
anaerobios, levaduras y algunas bacterias exigentes.
Los resultados presentan una correlación con las pruebas clásicas superior al 90%. Su
principal inconveniente radica en la incapacidad de detectar reacciones débiles.
b) Sistema Enterotube:
Consiste en un tubo de plástico dividido en compartimentos que contienen sustratos en
forma de agar. La inoculación se realiza directamente a partir de la colonia, por picadura y arrastre
a través de los diferentes sustratos. La lectura e interpretación no difieren del sistema anterior.
Existe comercializado para Enterobacterias y bacterias no fermentadoras. Los problemas de
este sistema son más considerables en cuanto al inóculo, que no siempre es uniforme, y a la
conservación de los sustratos.
D) PRUEBA DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
Es una técnica de identificación de microorganismos en la que se identifica el material
genético del microorganismo. Para ello se amplifica el ADN o el ARN de la bacteria o virus buscado,
luego se le une cadenas de ADN (sondas) complementarias de las amplificadas y específica para el
microorganismo buscado. Posteriormente se detecta esta unión por métodos enzimáticos y
colorimétricos