2.- Técnicas cromatografías

El funcionamiento de la cromatografía se basa en el diferente comportamiento de los componentes de la muestra al ser desplazados o retenidos por la acción conjunta y contrapuesta de una fase móvil que se hace pasar a través de una fase estacionaria.

-Fase móvil:

gas o líquido que produce el desplazamiento.

-Fase estacionaria

Soporte que retiene los componentes.
Separación de los componentes:
-Componentes unidos fuertemente a la fase estacionaria se mueven lentamente con la fase móvil.

-Componentes unidos débilmente a la fase estacionaria se mueven rápidamente al ser arrastrados por la fase móvil.

2.1.- Tipos de cromatografías

Según la fase móvil

-Cromatografía gaseosa, la fase móvil es un gas
-Cromatografía liquida, la fase móvil es un líquido.

Según el soporte de la fase estacionaria

-Cromatografía plana:

El soporte de la fase estacionaria es plano y puede ser un papel o un
gel sobre el que se desplaza la fase móvil por capilaridad o gravedad.

-Cromatografía en columna:

Tubo relleno de fase estacionaria sobre la que se inyecta una fase móvil de forma continua.

Partes del cromatograma

-Tiempo muerto

Tiempo en que tarda en salir la muestra.

-Tiempo de retención:

tiempo que tarda en salir una determinada molécula.

-Tiempo de retención corregido:

tiempo real que la fase estacionaria ha retrasado el avance.
-Línea base, señal producida cuando solo pasa la fase móvil.

Según el tipo de interacción que permite la separación

-Cromatografía de adsorción

La fase estacionaria es sólida y la fase móvil puede ser un
líquido o un gas. La separación depende de la polaridad de las moléculas de la muestra y se suelen hacer en columnas.
–

Cromatografía de reparto

Separa sustancias en dos fases liquidas inmiscibles

-Cromatografía en fase normal:

retiene componentes polares.
–

Cromatografía en fase reversa

Retiene componentes apolares.

-Cromatografía de intercambio iónico(1)

Sustancias se separa según su carga. La fase
móvil es un líquido y la fase estacionaria un sólido. El soporte (fase estacionaria) es fijo.
-Intercambiador catiónico, retiene las moléculas cargadas positivamente.
-Intercambiador aniónico, retiene las moléculas cargadas negativamente.

-Cromatografía de exclusión (2)

La fase estacionaria está formada por esferas de gel llenas de poros. Las sustancias se separan en función de su tamaño y su forma. La fase estacionaria es sólida y la fase móvil es líquida.

-Cromatografía de afinidad (3)

La fase estacionaria sólida es recubierta de Ac específicos para la sustancia que queremos separar. Se inyectan la muestra, los antígenos se unirán al anticuerpo específico y el resto de la muestra eludirá. Fase móvil líquida

3.- Osmometría

Medida del efecto osmótico de una solución, es decir, del número de partículas de soluto
disueltas en ella, y es independiente del tamaño o la carga de los iones o moléculas presentes.

-Osmolalidad:

número de partículas de soluto por unidad de masa de disolvente, es más
exacta.

– Osmolaridad

Número de partículas de soluto por unidad de volumen de la solución, es
menos exacta.

4.- Técnicas electroquímicas

Se basa en la medida de una señal eléctrica que se produce en un sistema en el que tiene
lugar una reacción química. El sistema básicamente está constituido por una solución
electrolítica y dos electrodos.
Principales técnicas:
– Potenciometria, mide la diferencia de potencial.
– Amperometria, mide la intensidad de corriente.

– Coulombimetria, mide la cantidad de carga necesaria para convertir por electrolisis el
componente de una sustancia que se analiza en otra sustancia.
– Conductimetria, mide la conductividad eléctrica de la solución de un electrolito.

4.1.- Técnicas amperométricas

Electrodo de O2 (electrodo de Clark)
Mide la presión parcial del O2y mide la intensidad de corriente cuando se aplica una
diferencia de potencial constante entre los electrodos.
Consta de una membrana permeable de O2, que recubre dos electrodos, un cátodo de
platino y un ánodo de Ag/AgCl, inmersos en una solución taponada de cloruro de potasio. Al
aplicar una corriente eléctrica de unos 700mV se produce la reducción del oxígeno
molecular dando iones hidroxilo.

3.- Espectrometría de absorción molecular

La espectrometría de absorción molecular se basa en la capacidad de las moléculas de
absorber una parte de la radiación. Las longitudes de onda que cada sustancia absorbe son
carácterísticas de la molécula y se pueden usar para identificarla.
– El análisis cuantitativo. Se realiza con radiaciones del UV-VIS. Es el análisis más usado en
los laboratorios de bioquímica.
– Análisis cualitativo. Radiaciones del IR y se usa para análisis de la composición de
cálculos urinarios.

3.1.- La absorción molecular

Los átomos de una molécula están unidos entre sí por diferentes orbitales de enlace que comparten electrones.

– Transición:

cambio en la estructura electrónica global de una molécula por absorción de energía.

– Radiación UV-VIS:

transición electrónica entre átomos.

– Radiación IR:

transición de vibración o rotación en las moléculas.

Transmitancia, absorbancia y espectro de absorción

La transmitancia (T) es el resultado de dividir la intensidad de luz transmitida (It) entre la intensidad de luz incidente (I0).

La absorbancia es el logaritmo inverso o negativo de la transmitancia:
El espectro de absorción es el conjunto de bandas (transiciones electrónicas) que indican la cantidad de luz absorbida por una sustancia a diferentes valores de longitud de onda, y es único o carácterístico de cada sustancia.

3.2.- La ley de Lambert-Beer

La ley de Lambert-Beer enuncia que la absorbancia de un analito es directamente
proporcional al coeficiente de absorción de la molécula, a la distancia recorrida por el haz de luz en la disolución y a la concentración de dicho analito.

Linealidad y desviaciones de la ley de Lambert-Beer

La linealidad es el intervalo de concentraciones entre las cuales existe una relación lineal
entre la concentración y la absorbancia (es decir, se cumple la ley de Beer)

Desviaciones instrumentales

– Alteraciones en la luz incidente.
– Errores en la rendija de salida.
– Errores debidos a la cubeta.
– Errores debidos al detector.

Desviaciones químicas

Controla las variaciones del pH.

Cálculo de la concentración a punto final

Se habrá agotado A, b y/o C Y se habrá formado en D y/o E.

Así, en las determinaciones con reactivos comerciales suele haber exceso de reactivos para asegurar que el analito reacciona en su totalidad en las condiciones de temperatura, pH y tiempo indicadas en los protocolos de trabajo.

la concentración de analitos es directamente proporcional a la concentración de alguno de los productos formados en la reacción

Medición a punto final en reacciones enzimáticas

En los métodos enzimáticos, la concentración del sustrato podrá determinarse a punto final. El método consiste en acoplar una reacción enzimática, de forma que la sustancia problema es sustrato de una enzima específica. Esta enzima transforma la sustancia problema en un producto coloreado que absorbe el UV-visible, de forma que pueda leerse en el espectrofotómetro.